一.履行旨趣巨乳 探花
质粒可佩戴一种或多种抗生素抗性基因，其赋予佩戴它们的细菌对特定抗生素的抗性。扣问东说念主员不错通过东说念主工采纳（即在抗生素存鄙人培养细菌），安谧地将含有该质粒的细菌与不含有该细菌的细菌分离。
Luria肉汤（LB）是一种富含养分的培养基，等闲用于培养履行室中的细菌。向LB中添加琼脂导致变成细菌不错滋长的凝胶，因为它们不可消化琼脂但不错从LB内积累养分。向该凝胶中添加抗生素只允许采纳那些对该抗生素具有抗性的细菌 - 等闲由佩戴抗生素抗性基因的质粒赋予。
LB琼脂平板常常用于分离佩戴特定质粒的细菌的个体菌落。然而，液体培养物不祥支撑更高密度的细菌，并用于培养富裕数目的细菌以分离富裕的质粒DNA用于履行用途。
二.试剂及履行器材准备
1.液体培养基配制：
胰卵白胨Tryptone：10g
酵母粉Yeast：5g
NaCl：10g
dH2O定容至1000ml
2.LB平板配制:
胰卵白胨Tryptone：10g
酵母粉Yeast：5g
NaCl：10g
琼脂糖：12g（责任浓度6-25g/L）
dH2O定容至1000ml
3.无菌平板（不可高压）：等闲使用60 mm x 15 mm平板，200ml琼脂浇筑4-5个平板（若琼脂太少过夜孵育后容易干裂），可在其上单独辞别最多约100个菌落
4. Falcon细胞流式管（不可高压）5.可高压灭菌的烧瓶：（用1L瓶制备400ml琼脂，在500ml瓶中制备200ml琼脂，需要特别的空间看护应许。）
6.抗生素：1000倍的储备溶液(氨苄青霉素钠，库存浓度100mg/ml，溶解后，0.22um过滤除菌，分装，-20℃保存数月。加入培养基时一定要等灭菌后的培养基冷却到40-50℃时再加入。含氨苄青霉素的培养基平板在4℃可保存2周。)
三.履行设施
1.溶解质粒： 将含观点基因质粒的 纸剪下（比画得圈稍大），并剪成碎屑，放入无菌EP管，加20到50ul无菌水或TEbuffer， 可用枪头将滤纸捣碎，室温过夜（或为了促溶，还可60℃水浴）。后旋涡回荡5min，离心，取上清即为质粒用于后续滚动。
2.LB液体培养基、LB平板粉末 搅动溶解后，121℃高压灭菌半小时，高压灭菌经过中高压釜胶带会变暗。液体LB 无菌环境下冷却至室温，扬弃4℃雪柜备用；LB平板 熔融凝胶羼杂物在凝固前转入40-50℃（视抗生素加入培养基温度而定）水浴锅，至少5分钟，备用。
3.准备培养皿、Falcon细胞流式管，紫外线消毒30min；（在培养皿上象征日历、抗生素特色。）
4.准备抗生素（要制备终浓度为100 ug/mL氨苄青霉素钠的平板，则应制备100，000 ug / mL（100 mg / mL）的储备溶液。测量100毫克氨苄青霉素钠粉末，将其加入1毫升水中，通过涡旋溶解，并过滤灭菌。）
5.添加抗生素至LB液体培养基、LB平板熔融凝胶羼杂物中（温度不宜过高，40-50℃（视抗生素理会温度而定，氨苄青霉素钠加入温度为40-50℃），看护抗生素理会）
6.浇筑LB平板：浇注后将盘子旋转以撤退气泡，确保琼脂在板底部均匀分散，凝固后格外。200ml琼脂浇筑4-5个平板（若琼脂太少——板过薄，过夜孵育后容易干裂）若浇筑经过瓶中的琼脂凝固，可再次通过高压灭菌器或微波炉将琼脂再行液化（用微波炉时看护应许！）室温下固化梗概需要30min，在室温下过夜使之干燥。在过夜干燥后，将板在4℃下（用PE手套包好）储存直至使用。
7.取感受态细胞置于冰浴中，如需分装可将刚融解细胞悬液分装到无菌预冷（提前冰上预冷1.5mlEp管）的离心管中，置于冰浴中。
得当：一次滚动感受态细胞的提倡用量为50-100ul，不错字据本色情况分装。所用DNA体积不向上感受态细胞悬液体积的1/10。（字据加入质粒体积提前准备无菌10ul无滤芯枪头）
8. 向感受态细胞悬液中加入观点DNA/ pUC19质粒（对照：证明感受态细胞是否有问题）（100ul的感受态细胞不祥被1ng超螺旋质粒DNA所饱和)，轻弹混匀，在冰浴中静置30min。
9. 将离心管置于42℃水浴中扬弃60-90s，然后快速将管转机到冰浴中，使细胞冷却2-3min，该经过不要摇动离心管。
得当：此设施也可将离心管置于室温进行，夏日或室温较高时，可扬弃5-8min， 要是室温较低，可延伸本领至8-15min。条款允许提倡使用42℃热激行径。
10. 向每个离心管中加入900ul无菌的LB培养基 （不含抗生素），混匀后置于37℃摇床回荡培养45 min (将1.5mlEp管水平扬弃，充分摇混匀)，观点是使质粒上相干的抗性象征基因抒发，使菌体复苏。
11. 将离心管内容物混匀，吸取100ul （第一次涂板，可开辟不同的梯度：20ul、50ul、70ul、100ul）已滚动的感受态细胞加到含相应抗生素的LB固体培养基上，用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被经受(15-20min)，格外平板，37℃培养12-16h（过夜）。
得当：涂布用量可字据具体履行来维持。如滚动的DNA总量较多，可取更小数滚动居品涂布平板；反之，如滚动的DNA总量较少，可取200-300ul滚动居品涂布平板。要是瞻望的克隆较少，可通过离心（4000rpm， 2min）后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。（涂布剩余的菌液可置于4℃保存，要是次日的滚动菌落数过少不错将剩下的菌液再涂布新的培养板。）
12. 使用无菌枪头或牙签，从LB琼脂平板上采纳一个菌落。
13. 将枪头或牙签放入液体LB +抗生素中并旋转。
14. 将细菌培养物在37℃下在回荡培养箱中 180rpm孵育12-18h。
15. 孵育后，查验滋长，其特征在于培养基中的玷污雾度。
得当：邃密的阴性对照是LB培养基+抗生素，莫得任何细菌接种。过夜孵化后，您应该看到这种培养物莫得滋长。
关于细菌的永久储存，采纳甘油。
1、配制30%（体积分数）的甘油水溶液，离心管多少灭菌备用.
2 、将细菌用富集培养基摇瓶培养过夜，字据储藏要求（有些要求高的神情中菌要达到一定OD值）培养.
3 、将菌液和灭菌的甘油水溶液按照2:1的体积比例在离心管中混匀（使最终甘油浓度为10%，其实甘油多点也不热切），-70°雪柜保存.
16. 用小提试剂盒从大肠杆菌培养物均分离质粒DNA。
17. 样品进行电泳检测：1%琼脂糖凝胶电泳，上样量为2ul，紫外灯下不雅察，最亮堂的带为超螺旋时势，不错在一定进程上标明提真金不怕火质粒的纯度。
18. 质粒纯化
1) 将之前提真金不怕火好的质粒放入1.5ml离心管中，加入1/10体积的3mol/L无菌乙酸钠溶液。
2) 加入2倍体积的无水酒精，扬弃于-20℃千里淀4-6h或过夜。
3) 4℃，高速离神思14000rpm，离心20min.
4) 弃去上清，70%酒精洗2次。
5) 空气干燥，可置超净责任台干燥。
6) 加200ul无菌水溶液干燥后所得千里淀，即为质粒溶液。
7) 紫外分光光度计测量质粒浓度和产量。
四.领导和常见问题
妖媚婷儿 勾引(1)高拷贝质粒和低拷贝质粒有什么区别？
拷贝数是指单个细菌细胞内单个质粒的拷贝数。大质粒等闲具有低拷贝数（每个细胞梗概一个或两个拷贝）况兼它们需要滋长更长的本领段（梗概18-30小时）。另一方面，较小的质粒不错大宗存在，每个细胞50个或更多，况兼具有高拷贝数。高拷贝数质粒应该仅需要平均滋长12-16小时。无论质粒大小怎样，质粒的某些特征可使其低拷贝。请参阅质粒的信息页面以细目您的质粒是高拷贝已经低拷贝。
(2)过夜孵化后，我莫得任何增长。什么所在出了错？
尝试将文化培养更多本领。一些细菌培养物滋长得更慢。此外，在30°C而不是37°C温育的细菌等闲需要更长的孵育本领。
仔细查验LB培养基中的抗生素是否与质粒上的抗生素抗性相匹配。
要是LB琼脂平板上的细菌不是崭新的，你应该将细菌划到新的LB琼脂平板上，然后在液体培养基中滋长。
更多的曝气可能有助于增多培养物的密度。等闲培养物在150-250rpm下摇动巨乳 探花，将其增多至350-400rpm以赢得更高的细胞密度。